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幽門螺旋桿菌的免疫學檢測

基本信息

  • 專科分類： 生長發育檢查
  • 檢查分類： 血液檢查
  • 適用性別： 男女均適用
  • 是否空腹： 　空腹
  • 手術參考價： 45元
  • 科　室： 生長發育檢查

幽門螺旋桿菌的免疫學檢測檢查簡介

幽門螺桿菌免疫學檢查是通過測定血清中的幽門螺旋桿菌抗體來檢測幽門螺旋桿菌感染，包括補被動血凝測定、免疫印跡技術和酶聯合吸附測定(ELISA)等。

幽門螺旋桿菌的免疫學檢測檢查過程

一、被動血凝測定

患者刺取腦脊液，采用稀釋抗原固定血清法用96孔V型微量血凝板,將乙腦抗原作倍比稀釋,使每孔含25uL,被檢血清用稀釋液作1：10稀釋,每孔加人25uL產,再滴加凍干乙腦單克隆抗體致敏羊血紅細胞25uL，37℃下放置數小時后觀察結果。

二、免疫印跡技術

(一)蛋白質樣品獲得：細菌誘導表達后，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細胞，真核細胞加勻漿緩沖液，機械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。

(二)電泳：制備電泳凝膠，進行SDS-PAGE。

(三)轉移：(半干式轉移)

1、電泳結束后將膠條割至合適大小，用轉膜緩沖液平衡，5min×3次。

2、膜處理：預先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉膜緩沖液中10min。

3、轉膜：轉膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜精確對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2，轉移1.5hr。轉移結束后，斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標準的條帶染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結果作對比。

(四)免疫反應：

1、用0.01MPBS洗膜，5min×3次。

2、加入包被液，平穩搖動，室溫2hr。

3、棄包被液，用0.01MPBS洗膜，5min×3次。

4、加入一抗(按合適稀釋比例用0.01MPBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部)，4℃放置12hr以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實驗組相同。

5、棄一抗和1%BSA，用0.01MPBS分別洗膜，5min×4次。

6、加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗(按合適稀釋比例用0.01MPBS稀釋)，平穩搖動，室溫2hr。

7、棄二抗，用0.01MPBS洗膜，5min×4次。

8、加入顯色液，避光顯色至出現條帶時放入雙蒸水中終止反應。

三、酶聯合吸附測定

常用的ELISA法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測大分子抗原，后者用于測定特異抗體。

1.間接ELISA

本法主要用于檢測抗體。間接ELISA的操作程序如下。

(1)材料

①包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液;

②DVH包被抗原、酶標抗抗體、陰性及陽性DVH參考血清.

③ELISA檢測儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。

(2)方法步驟

①加抗原包被→4℃過夜，洗滌三次、拋干

②加待檢血清→37℃2小時，洗滌三次、拋干

③加酶標抗體→37℃2小時，洗滌三次、拋干

④加底物液→37℃30分鐘，加終止液

⑤用ELISA檢測儀測定OD值，并計算出P/N比值。

2.雙抗體夾心ELISA

本法主要用于檢測大分子抗原。

①加抗體包被→4℃過夜，洗滌三次、拋干

②加待檢抗原→37℃30分鐘，洗滌三次、拋干

③加酶標抗體→37℃30分鐘，洗滌三次、拋干

④加底物液→37℃15分鐘，加終止液

⑤用ELISA檢測儀測定OD值。

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